利用基因工程，科學家發明可以程式化的3D列印活體生物墨水！

3D 列印這一技術概念從最早推出到如今已經不僅在科研領域受到廣泛關注，在產業領域也已初具規模。在汽車、航空航太、軍工等製造業，以及醫療、文創、教育等諸多行業已有很多具體 3D 列印的應用，成型的材料還基本都是金屬或非金屬，並以粉末狀、線狀和液態為主。

隨著 3D 列印技術與市場的日趨成熟，其與電腦圖形學、機器人學、生命科學、材料科學等領域的交叉愈發廣泛，多學科的融合程度逐漸深化，這也為 3D 列印提供了更為豐富的可能性和廣闊的發展前景。而 3D 生物列印正是從 3D 列印逐層構建材料並最終形成產品的增材製造過程演化而來，其能夠生產可精確控制的組織複雜度類似的 3D 組織構建物。

而該技術的關鍵就在於列印的材料，並且也繼承了 3D 列印一貫對材料的高要求。不再是以往的金屬或者非金屬，3D 生物列印中使用的材料包含活細胞和生物材料，一般被稱為「生物墨水」。

做為列印材料，生物墨水首先要有很好的生物活性，類似於體內細胞外基質一般，以便在列印成型後細胞能進一步發育並建立起細胞間的聯繫。其次就是要求具有很好的成形性，而且是在列印時要好的流動性，列印後又能很快地固化成型。

目前，利用微生物工程生產面向各種不同應用的材料已取得一定成果，但以任意的模式和形狀來構建3D機構卻始終是一項很大的挑戰。

近日，由美國哈佛大學的約翰‧保爾森工程與應用科學學院、威斯生物工程研究所、醫學院醫學部和工程部，以及美國東北大學化學與化學生物學系的學生們一同完成了一項關於生物墨水的研究。他們的研究工作將先進的奈米生物技術與活性材料技術相結合，為 3D 生物列印技術生產功能性「活體」開闢了新空間。這項研究也發表在了自然雜誌的子刊 Nature Communications 上。

▲ Programmable microbial ink for 3D printing of living materials produced from genetically engineered protein nanofibers

充分利用微生物的遺傳可程式編輯性

活細胞具有合成分子成分的能力，並且能夠在奈米尺度上精確地進行組裝，因為具有在適當環境條件下構建宏觀的活體功能結構。

來自哈佛大學的 Anna 和 Avinash 帶著研究團隊著手開發一種，被他們叫做「微生物墨水（microbial ink）」的列印材料。

它完全由基因工程微生物細胞所製成，經過程式化設計使蛋白質單體自下而上的分層自組裝為奈米纖維，並進一步構成包含了可擠出水凝膠的奈米纖維網路。透過將基因工程大腸桿菌（E.coli）細胞和奈米纖維嵌入微生物墨水中，研究人員向外界進一步展示了功能生物材料的 3D 列印技術；該技術可以有效地隔離有毒部分，釋放生物製劑，並透過合理設計的遺傳物質，經化學誘導來調節自身細胞的生長。

實際上，3D 生物列印在組織工程學背景下，列印哺乳動物細胞的技術相對成熟一些，最近已經用在了列印生物技術和生物醫學領域所需要的微生物細胞。但如今已經探索出的噴墨印刷（inkjet printing）、接觸印刷（contact printing）、絲網印刷（screen printing）和平版印刷（lithographic）等技術，相比於基於擠壓法（extrusion-based）的生物印刷技術，在相容性、性價比上都略顯不足。因此，在這個概念下有很多的方法路徑研究，也探索出了許多種生物墨水。

但是迄今為止，還沒有人充分利用微生物的遺傳可程式編輯性來合理地控制生物墨水的機械特性。

研究人員認為出於對多種因素的考慮，這個想法對於可持續的製造實踐應用、在資源貧乏環境（比如一些荒蕪的陸地或外星宇宙）中製造原材料，以及透過仿生設計和基因工程的精確性增強材料性能等領域都將起到推動作用。這就是 Anna 和 Avinash 要進行該專案研究的初衷。

他們對最終目標的設想分為三個階段，首先是設計出一種具有高列印保真度的可擠出生物墨水；然後再透過「自下而上」的方法完全由工程微生物來生產這種生物墨水；最後，則是創建出一個可程式設計的平臺，在更大更宏觀的層面實現 3D 列印活體結構的先進功能，進而將新興的活體材料領域推向從未被開發的尖端科技藍海中。

利用基因工程

在這項工作中，他們做出了完全由基因工程的大腸桿菌生物膜製備出的微生物墨水。並且他們在論文中詳細介紹了這款微生物墨水的具體特徵，展示了其結構和形狀的完整性。

更為長遠的影響是，他們透過將基因工程的大腸桿菌細胞嵌入到微生物墨水裡，顯示了 3D 列印治療性生物材料、隔離性生物材料和可調節性生物材料等多種潛在生物墨水的可能。

▲ 微生物墨水的設計策略、生產和功能應用示意圖（圖片來源：Nature Communications）在圖中的 a 部分，研究人員將源自纖維蛋白的 α（旋鈕）和 γ（孔）蛋白結構域，與捲曲奈米纖維的主要結構成分 CsgA 相結合，對大腸桿菌進行基因工程改造以產生微生物墨水。

分泌後，CsgA-α 和 CsgA-γ 單體透過球狀孔結合相互作用自組裝成交聯的奈米纖維。b展示了旋鈕和孔域來自於纖維蛋白，它們在血凝塊形成過程中的超分子聚合環節起到了關鍵作用。圖中的 c 則顯示，整個從工程蛋白質奈米纖維來生產微生物墨水的方案，涉及標準的細菌培養、有限的加工步驟，並且不必添加外源聚合物。最後微生物墨水被 3D 列印，來獲得功能性生物材料。

這個設計的想法是基於研究團隊的早期工作基礎，在之前 Anna 和 Avinash 證明了大腸桿菌生物膜細胞外基質（ECM）的原生蛋白捲曲奈米纖維可透過將功能性多肽/蛋白質融合到捲曲 CsgA 的單體中來進行基因工程編輯，進而產生剪切稀釋水凝膠。同時，為了創造出具有理想黏彈性的生物墨水，他們又引入了一種遺傳工程的交聯策略，這個靈感就來自於纖維蛋白（上圖 b 中顯示的部分）。

這項研究所製備出的微生物墨水，其設計重新利用了 alpha 和 gamma 模組之間的結合相互作用，即「旋鈕-孔（knob-hole）」的相互作用，病引入奈米纖維之間的非共價交聯，以求在保持剪切稀釋性能的同時增強機械堅固性。此外，研究人員表示，該實驗中還值得注意的是，由 CsgA 自組裝形成的纖維具有高度穩定性，並能抵抗蛋白水解、洗滌劑誘導和熱變性等多種優點。

合成生物學新工具

可列印的生物墨水需要黏度足夠低，並且既要便於擠壓，又要足夠高的強度以便在列印後保持其形狀。

這項成果，對於 3D 生物列印技術領域開發具有可調機械強度、高細胞活力和高列印保真度的高級生物墨水，起到了很大的推動作用，擴展了研究思維。

在他們看來，未來利用合成生物學家們研發出的、能夠不斷增長的生物部件「工具包」，微生物墨水可以進一步為各種生物技術和生物醫學應用進行個性化的定制設計。特別是當需要與其他材料技術相結合時，例如那些已經將活細胞納入結構建築材料的技術，該研究所製備的微生物生物墨水會尤其重要。

此外，其也可以在類似太空等極端環境下的人類棲息地，支援結構建築物的建成；因為在那種環境下原材料的運輸是極為困難的，所以從非常有限的資源中按需製作建築材料是必須要考慮的問題。

總體來看，目前 3D 生物列印尚且處於初始研發階段，生物墨水作為生物 3D 列印技術環節上的關鍵材料，也是該領域的研究重點。

對於市場應用來說，這些技術談及規模化、市場化還為時尚早。但該研究領域的未來發展潛力極大，可涉及的應用也十分廣泛，包括個性化醫療器械、新型生物材料的研發、3D支架和3D細胞培養、再生醫學、多細胞生物學結構體構建，以及文中研究人員所設想的建築材料等等。

可以說，生物 3D 列印技術正以極快的速度向前發展著，其已經讓各種手術和再生醫學等領域大大受益。未來，讓我們期待該領域能夠湧現更多的可以改善人類社會、變革相關產業的技術。

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